Jurnal Bab 3

Oleh Aprovta Mess

213,7 KB 3 tayangan 0 unduhan
 


Bagikan artikel

Transkrip Jurnal Bab 3

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN Pada bab ini dijelaskan lebih lanjut mengenai bahan dan alat, metode penelitian, tahapan penelitian, dan skema kerja. 3.1. Bahan dan Alat 3.1.1. Bahan Penelitian Bahan tanaman yang digunakan adalah daun cengkeh yang segar yang diperoleh dan dideterminasi dari perkebunan di desa Lebakrejo kecamatan Purwodadi Pasuruan, Jawa Timur. Dalam penelitian ini digunakan minyak atsiri dan air sisa destilasi yang diperoleh dari destilasi daun cengkeh dengan menggunakan alat destilasi Stahl. 3.1.2. Bahan-Bahan lain Aquadest steril, spiritus, H2SO4 pekat (Riedel de Haen), BaCl2.2H2O, Silika Gel 60F254, toluen p.a., etil asetat p.a., etanol 96% p.a., asam asetat glasial p.a., methanol p.a., vanillin H2SO4, Mueller Hinton Broth (E. Merck), Mueller Hinton Agar (E. Merck), Mannitol Salt Agar (E. Merck), Tryptone Yeast Cystine Agar (M. London), Brain Heart Infusion Broth (E. Merck), Na2SO4 eksikatus p.a., Dimethyl Sulfoxide (DMSO), larutan Crystal Violet modifikasi Hucker, larutan Iodium untuk pengecatan Gram, larutan alkohol aseton (7:3), larutan Safranin Gram Stain, pereaksi dan bahan-bahan untuk skrining fitokimia, minyak emersi, eter, lisol, larutan kloralhidrat 50%, Fluoroglucin-HCl pekat 10%, H2O2 3% dan etanol 96%. 39 40 3.1.3. Alat – alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat destilasi Stahl, autoclave (All American, model 25×), inkubator (Memmert. Type B30, West Germany), oven listrik (Memmert. Type B30, West Germany), lemari es (Hitachi R-528, Japan), freeze dryer (Taitec VD-800F), mikroskop binokuler dan perlengkapannya, refraktometer Abbe, water bath (SALVIS 0LM 2), mesin penggiling daun (Jimo Disk Mill Model FFC15), lemari asam, lemari aseptis, timbangan analitis (Sartorius BA 160 P, Gottingen, Jerman), alat-alat gelas, cawan petri diameter 9 cm dan 15 cm, pipet ukur, mikropipet (Eppendorf pipette 20 µl), bejana Kromatografi (CAMAG) ukuran 20×15×5 cm, alat penampak bercak, piknometer, termometer, kawat inokulasi, pinset, bunsen, spiritus brander, cawan porselen, kertas saring, kertas lensa, kertas perkamen, batang pengaduk, jangka sorong (Schlieper, Jerman), lampu UV λ 254 nm dan 366 nm, perforator, Plate Silika Gel dan pipa kapiler 10 µl. 3.1.4. Bakteri Uji Bakteri Streptococcus mutans yang digunakan pada penelitian ini didapat dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya. Bakteri Staphylococcus aureus yang digunakan pada penelitian ini didapat dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya. 3.2. Metode Penelitian Penelitian yang dilakukan ini adalah jenis penelitian eksperimental, yaitu data yang diperoleh didapat dari hasil penelitian. Penelitian ini digunakan untuk membuktikan kebenaran suatu hipotesis dengan uji kebenaran melalui eksperimen yaitu untuk menguji daya antibakteri dari 41 minyak atsiri dan air sisa destilasi labu dan buret dari daun cengkeh terhadap Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans. Variabel penelitian meliputi variabel bebas, variabel tergantung, dan variabel yang disamakan. Variabel bebas adalah konsentrasi minyak atsiri dan air sisa destilasi dari daun cengkeh. Variabel tergantung adalah besarnya Daerah Hambatan Pertumbuhan (DHP) dan Kadar Hambat Minimum (KHM) yang dihasilkan oleh zat yang diujikan. Variabel yang disamakan adalah laju destilasi, lama destilasi, jumlah daun cengkeh yang didestilasi, jumlah air yang digunakan untuk destilasi, suhu inkubasi, waktu panen, waktu pengamatan yang dilakukan setelah inkubasi dan suspensi bakteri yang digunakan untuk diberi perlakuan. Uji daya antibakteri dilakukan dengan metode difusi sumuran dan metode dilusi cair untuk memperoleh data berupa DHP dan KHM. Penelitian ini meliputi penyiapan dan identifikasi bahan, pembuatan dan karakterisasi simplisia (serbuk), skrining fitokimia, destilasi dengan alat Stahl dengan hasil minyak atsiri dan air sisa destilasi labu dan buret, analisis minyak atsiri dan air sisa destilasi labu dan buret, serta uji daya antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans. Untuk mengetahui seberapa besar daya antibakteri dari larutan uji, maka digunakan eugenol sebagai pembanding. 3.3. Tahapan Penelitian 3.3.1. Cara Pengambilan Daun Cengkeh Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah daun cengkeh (Eugenia caryophyllata Thumb.) yang dikumpulkan dari perkebunan desa Lebakrejo, kecamatan Purwodadi. Daun diambil secara acak dengan cara pengundian dari beberapa pohon dalam satu lokasi yang sama. Pohon yang dipilih adalah pohon yang sedang berbunga. Pada lahan tersebut terdapat 125 pohon, masing-masing pohon diberi nomor dan selanjutnya 42 dilakukan pengundian hingga dipilih 10 pohon untuk diambil daunnya. Daun diambil dari ranting pohon nomor 2 dari atas dan nomor 3 dari bawah, diambil dari arah timur, barat, utara dan selatan yang diambil sekitar 94 helai daun dari empat arah tersebut dengan berat rata-rata daun 0,525 gram dan total dari 1 pohon yaitu 100 gram daun cengkeh segar. Daun yang diambil adalah daun dewasa yang berwarna hijau tua, tidak berlubang dan masih utuh, karena mempunyai kandungan minyak atsiri yang maksimal. Dari 10 pohon diperoleh 1 kilogram daun cengkeh segar dan jika dikeringkan menjadi 500 gram daun cengkeh kering. 3.3.2. Pemeriksaan Organoleptis Daun Cengkeh Daun cengkeh diperiksa secara organoleptis terhadap warna, rasa dan bau ciri morfologisnya. Pengamatan dilakukan di lapangan dan di laboratorium. 3.3.3. Pemeriksaan Makroskopis Daun Cengkeh Pemeriksaan makroskopis meliputi jenis, letak, bentuk, pangkal, ujung, tepi, permukaan dan pertulangan daun. 3.3.4. Pemeriksaan Mikroskopis Daun Cengkeh Daun yang masih segar diiris tipis tegak lurus tulang daunnya, diletakkan di atas kaca obyek dengan media air. Kemudian secara berturut-turut diberi pereaksi larutan kloralhidrat 50%, dipanaskan dengan spiritus brander sebentar, lalu diberi pereaksi fluoroglucin-HCl pekat 10%. Pengamatan dengan mikroskop dilakukan pada pembesaran 100x dan 400x. 43 3.3.5. Pembuatan Serbuk Simplisia yang digunakan untuk penelitian ini adalah daun cengkeh segar berwarna hijau tua, dicuci bersih dan dikeringkan untuk mengurangi kadar air pada daun, kemudian dibuat serbuk dengan dimasukkan ke dalam alat penggiling daun. Dibuat menjadi serbuk ini bertujuan untuk memecah sel-sel minyak dan memperluas permukaan, sehingga minyak dapat lebih mudah keluar dari dalam selnya. Serbuk yang diperoleh sebelum digunakan untuk penelitian diperiksa secara makroskopis dan mikroskopis. Tiap kali destilasi dibutuhkan 50 gram serbuk daun cengkeh atau sekitar 94 helai daun cengkeh segar (Departemen Kesehatan RI, 1989). 3.3.6. Penetapan Kadar Abu (Departemen Kesehatan RI, 2000) Ditimbang seksama ± 2 gram hingga 3 gram serbuk, dan dimasukkan ke dalam krus porselen yang telah dipijarkan dan ditara, lalu diratakan. Kemudian dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, didinginkan, dan ditimbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan. Kadar abu = W kons Keterangan : Wkonstan (k+s) Wkonstan (k) Wkonstan (s) tan (k + s ) − W kons W kons tan (s ) tan (k ) x100 % = bobot konstan krus + serbuk (gram) = bobot konstan krus (gram) = bobot konstan serbuk (gram) 3.3.7. Penetapan Susut Pengeringan (Departemen Kesehatan RI, 2000) Ditimbang seksama ± 5 gram serbuk daun cengkeh dalam cawan timbang dangkal, diletakkan pada alat IR Moisture Balance Model FIA yang telah ditara, kemudian serbuk tersebut diratakan. Termometer dipasang dan lampu infrared diarahkan pada serbuk. Selama penyinaran 44 suhu dijaga agar tidak lebih dari 105ºC. Skala Balance diatur supaya tetap seimbang. Bila skala tersebut konstan, nilai yang tertera pada skala dibaca (Departemen Kesehatan RI, 1979). 3.3.8. Pemeriksaan Kadar Sari Larut Etanol dan Air (Departemen Kesehatan RI, 2000) Ditimbang masing-masing 0,5 g simplisia, dimaserasi dengan 5 ml etanol atau aquades, dibiarkan selama 30 menit, lalu disaring, kemudian diuapkan di WB 50°C hingga didapatkan ekstrak kental, lalu ekstrak kental tersebut ditimbang. Ditentukan kadar sari larut etanol atau air dengan rumus: Kadar sari larut etanol dan air = berat ekstrak kental x100 % berat simplisia 3.3.9. Skrining Fitokimia (Fong et al., 1978) a. pemeriksaan alkaloid Sebanyak 2 gram serbuk daun cengkeh dengan 5 ml amoniak 50%, digerus dalam mortir, ditambahkan 20 ml kloroform dan digerus kembali kuat-kuat dan disaring. Filtrat ditampung dan diambil beberapa tetes kemudian diteteskan pada kertas saring yang sebelumnya telah ditetesi dengan pereaksi Dragendorff. Penampakan warna pada kertas saring diamati dan jika terbentuk warna merah atau jingga pada kertas saring menunjukkan adanya alkaloid. Sisa filtrat diekstraksi dengan larutan asam klorida 10%. Hasil ekstraksi diambil 10 ml dan dimasukkan ke dalam 2 tabung reaksi masing-masing 5 ml. Selanjutnya ditambahkan pereaksi Dragendorff dan pereaksi Meyer. Terbentuknya endapan merah bata dengan pereaksi Dragendorff dan endapan putih dengan pereaksi Meyer menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid. 45 b. pemeriksaan flavonoid Sebanyak 1 gram serbuk daun cengkeh ditambah 100 ml air panas dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Filtrat ditampung dan selanjutnya akan digunakan sebagai larutan percobaan. Ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml filtrat ditambahkan serbuk magnesium, 1 ml asam klorida pekat, dan 2 ml amil alkohol, selanjutnya dikocok kuat-kuat dan dibiarkan memisah. Terbentuknya warna merah jingga atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid. c. pemeriksaan saponin Sebanyak 10 ml filtrat pada larutan percobaan flavonoid dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dikocok secara vertikal kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuknya busa setinggi 1-10 cm yang stabil kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin. d. pemeriksaan tanin Sebanyak 10 gram serbuk daun cengkeh ditambah 100 ml air, dididihkan selama 15 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dibagi 3 dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ke dalam tabung reaksi pertama ditambahkan larutan besi (III) klorida 1%. Terbentuknya warna biru tua, hijau violet atau hitam menunjukkan adanya tanin. Ke dalam filtrat tabung kedua ditambahkan gelatin, jika terbentuk endapan menunjukkan adanya tanin. Pada filtrat tabung ketiga ditambahkan 15 ml pereaksi Steasny (campuran formaldehid 30% : HCl pekat = 2:1) dan dipanaskan dalam penangas air. Terbentuknya endapan merah muda menunjukkan adanya tanin katekat. Selanjutnya endapan disaring dan filtrat dijenuhkan 46 dengan natrium asetat dan ditambahkan beberapa tetes besi (III) klorida 1%, terbentuknya warna biru tinta menunjukkan adanya tanin galat. e. pemeriksaan kuinon Sebanyak 5 ml larutan percobaan pada pemeriksaan flavonoid dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan beberapa tetes natrium hidroksida 1 N. Terbentuknya warna merah menunjukkan adanya kuinon. f. pemeriksaan steroid triterpenoid Sebanyak 1 gram serbuk daun cengkeh dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, kemudian disaring. Sebanyak 5 ml filtrat diuapkan dalam cawan penguap hingga kering, residu ditambah 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat. Terbentuknya warna merah yang berubah menjadi hijau kemudian menjadi ungu dan akhirnya biru menunjukkan golongan steroid triterpenoid. 3.3.10. Isolasi Minyak Atsiri dan Air Sisa Destilasi Daun Cengkeh Lima puluh gram daun cengkeh kering yang telah diperkecil ukurannya dengan alat penggiling, dimasukkan ke dalam labu destilasi. Ke dalam labu ditambahkan 500 ml aquadest sebagai pelarut, selanjutnya alat destilasi Stahl dipasang dan buret diisi dengan air hingga penuh, kemudian dipanaskan dengan heating mantle. Destilasi dilakukan selama 4 jam. Setelah 4 jam dibiarkan dingin dahulu selama 15 menit. Minyak atsiri yang terpisah dikumpulkan terlebih dahulu, kemudian air sisa destilasi buret ditampung di tempat terpisah dan diukur volumenya. Untuk air sisa destilasi labu disaring terlebih dahulu karena masih bercampur dengan simplisia (serbuk), kemudian diukur volumenya. Minyak yang telah ditampung tersebut masih mengandung air, oleh karena itu ditambahkan Na2SO4 anhidrat untuk pembebasannya dengan 47 air. Setelah dibebaskan dari air, diukur volumenya dan ditentukan persentase kandungan minyak atsiri dengan rumus = (Volume minyak : berat daun segar) x 100%. Demikian pula dengan air sisa destilasinya dilakukan pengukurannya terhadap volumenya (Departemen Kesehatan RI, 1979; Departemen Kesehatan RI, 1985). 3.3.11. Penetapan Spesifikasi Minyak Atsiri dan Air Sisa Destilasi Daun Cengkeh a. pengamatan organoleptis Pengamatan organoleptis minyak atsiri dan air sisa destilasi labu dan buret daun cengkeh meliputi bau, rasa dan warna. Pengamatan ini tidak dapat digunakan untuk menggambarkan mutu minyak atsiri dan air sisa destilasi secara tepat. b. penetapan indeks bias (Departemen Kesehatan RI, 1985). Penentuan indeks bias dilakukan dengan menggunakan alat refraktometer Abbe. Cara penentuannya adalah sebagai berikut: 1. Minyak atsiri diteteskan pada permukaan prisma refraktometer. 2. Alat ditutup dan cahaya dibiarkan melewati cairan minyak tersebut. 3. Knop prisma diputar sehingga warna cahaya pada layar dalam alat refraktometer menjadi 2 warna dengan batas yang jelas. 4. Tanda batas tersebut digeser dengan memutar knop pengatur halus prisma sampai memotong titik perpotongan 2 garis diagonal yang saling berpotongan pada layar. 5. Diamati dan dibaca skala indeks bias yang ditunjukkan oleh jarum pada layar skala. 48 6. Nilai indeks bias yang teramati pada suhu ruang dikonversi menjadi nilai indeks bias pada suhu 20°C dengan menggunakan rumus: N Dimana : 20 D = n dt + 0 , 00041 (t − 20 ) N D20 = indeks bias pada suhu 20°C = indeks bias yang teramati pada t (suhu ruang) n dt c. pemeriksaan kelarutan (Departemen Kesehatan RI, 1985). Minyak cengkeh sebanyak 1 ml diukur secara teliti kemudian ditempatkan di dalam gelas ukur 10 ml, ditambahkan 2 ml etanol 70% setetes demi setetes, dan pada setiap penambahan dilakukan pengocokan sehingga diperoleh larutan sejernih mungkin. Begitu juga untuk etanol 96%, minyak cengkeh sebanyak 1 ml diukur secara teliti kemudian ditempatkan dalam gelas ukur 10 ml, ditambahkan etanol 96% 1 ml setetes demi setetes hingga diperoleh larutan sejernih mungkin. 3.3.12. Pengujian Minyak Atsiri dan Air Sisa Destilasi Labu dan Buret Daun Cengkeh secara Kromatografi Lapis Tipis a. pembuatan larutan uji dari minyak atsiri dan air sisa destilasi labu dan buret daun cengkeh Ditimbang minyak atsiri, air sisa destilasi labu dan buret daun cengkeh, masing-masing 200 mg dan kemudian dilarutkan dalam metanol sampai 10 ml lalu dikocok homogen. b. pembuatan larutan pembanding eugenol Ditimbang 100 mg eugenol standar, kemudian dilarutkan dalam metanol sampai 10 ml dan dikocok homogen. 49 c. pelaksanaan kromatografi lapis tipis Larutan minyak atsiri dan air sisa destilasi (labu dan buret) dibuat konsentrasi 20.000 µg/ml, serta larutan pembanding eugenol dengan konsentrasi 10.000 µg/ml ditotolkan dengan volume 10 µl pada tiga lempeng Silika Gel 60F254 berukuran 10 cm × 6,5 cm dan masing-masing dieluasi dengan fase gerak toluen : etil asetat (93:7), toluen : etil asetat (70:30), dan klorofom : etanol : asam asetat (94:5:1) (Tan, 1999; Ambeno, 2007). Noda yang dihasilkan diamati dengan sinar UV 254 nm dan 366 nm serta dengan penampak noda vanilin-H2SO4, kemudian dipanaskan pada pemanas yang mempunyai sisi halus untuk menempatkan dan memindahkan pelat KLT pada suhu 110°C selama 510 menit yang diamati secara visual dan dihitung harga Rf-nya (Wagner et al., 1984; Stahl, 1985). 3.3.13. Pembuatan Media Pertumbuhan Bakteri a. Mueller Hinton Broth (MHB) Ditimbang 21 gram MHB dan dicampur dengan air suling 1 liter. Kemudian MHB dipanaskan sambil diaduk-aduk sampai terbentuk larutan yang jernih, dijaga agar volumenya tetap 1 liter. Lalu dimasukkan dalam Erlenmeyer volume 500 ml, tiap Erlenmeyer diisi 250 ml media sebanyak empat buah Erlenmeyer dan ditutup dengan sumbat kapas, lalu disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit, pH media 7,4 ± 0,2 pada suhu 25ºC. b. Mueller Hinton Agar (MHA) Ditimbang 34 gram MHA dan dicampur dengan air suling 1 liter. Kemudian MHA dipanaskan sambil diaduk-aduk sampai terbentuk larutan yang jernih dan dijaga agar volumenya tetap 1 liter. Larutan 50 sebanyak 30 ml dan 10ml dituang ke dalam masing-masing tabung reaksi dan ditutup dengan sumbat kapas, lalu disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121º C selama 15 menit, pH media 7,4 ± 0,2 pada suhu 25ºC. c. Mannitol Salt Agar (MSA) Ditimbang 108 gram MSA dan dicampur dengan air suling 1 liter. Kemudian MHA dipanaskan sambil diaduk-aduk sampai terbentuk larutan yang jernih dan dijaga agar volumenya tetap 1 liter. Larutan sebanyak 5 ml dituang ke dalam masing-masing tabung reaksi dan ditutup dengan sumbat kapas, lalu disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit, pH media 7,4 ± 0,2 pada suhu 25ºC. d. Brain Heart Infusion Broth (BHIB) Ditimbang 37 gram BHIB dan dicampur dengan air suling 1 liter. Kemudian BHIB dipanaskan sambil diaduk-aduk sampai terbentuk larutan yang jernih dan dijaga agar volumenya tetap 1 liter. Lalu dimasukkan dalam Erlenmeyer volume 500 ml, tiap Erlenmeyer diisi 250 ml media sebanyak empat buah Erlenmeyer dan ditutup dengan sumbat kapas, lalu disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit, pH media 7,4 ± 0,2 pada suhu 25ºC. e. Tryptone Yeast Cystine (TYC Agar) Ditimbang 98 gram TYC Agar dan dicampur dengan air suling 1 liter. Kemudian TYC Agar dipanaskan sambil diaduk-aduk sampai terbentuk larutan yang jernih, dan dijaga agar volumenya tetap 1 liter. Larutan sebanyak 30 ml dan 10 ml dituang ke dalam masing-masing tabung reaksi, dan ditutup dengan sumbat kapas, lalu disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit, pH media 7,3 ± 0,2 pada suhu 25ºC. 51 f. Blood Agar Blood agar base ditimbang 40 gram dan dilarutkan dalam 950 ml aquadest, kemudian dipanaskan sampai media larut sambil dijaga supaya volumenya tetap. Kemudian dimasukkan dalam Erlenmeyer volume 250 ml sebanyak 95 ml dan disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit, lalu didinginkan pada suhu 45-50ºC. Darah domba steril sebanyak 50 ml yang telah didefibrinasi ditambahkan secara aseptis ke dalam masing-masing Erlenmeyer sebanyak 5 ml dan dicampur sampai homogen. Setelah itu dituang ke dalam cawan petri steril. Nilai pH media ini adalah 6,8 ± 0,2 pada suhu 25ºC. g. Methyl Red-Voges Proskauer Broth Ditimbang 850 mg MR-VP Broth dan dicampur dengan air suling 50 ml, kemudian diaduk-aduk sambil dipanaskan sampai larut sempurna, serta dijaga volumenya agar tetap. Kemudian dimasukkan dalam Erlenmeyer 100 ml dan disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit, pH media 6,9 ± 0,2 pada suhu 25ºC. 3.3.14. Pemeriksaan Bakteri Staphylococcus aureus a. makroskopis Staphylococcus aureus diinokulasi dengan penggoresan dari media MHB ke dalam cawan petri, kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Pengamatan secara makroskopis yang dilakukan meliputi bentuk, warna, tepi, kenaikan permukaan, tekstur dan ukuran koloni. Pada media MSA, ciri-ciri koloni Staphylococcus aureus adalah berbentuk bulat dengan diameter 0,5-1,5 mm, berwarna putih kekuningan sampai kuning keemasan, tepi utuh, kenaikan permukaan cembung, dan bertekstur opaque, mukoid dan halus. 52 b. mikroskopis Pengamatan secara mikroskopis dilakukan menggunakan mikroskop dengan perbesaran lensa 10x100 dengan bantuan pengecatan Gram meliputi bentuk sel, susunan sel, ukuran sel, reaksi Gram serta ada atau tidaknya endospora. Cara pelaksanaan pengecatan Gram tersebut diawali dengan kaca obyek yang dibersihkan dengan alkohol, lalu dibilas dengan air dan dikeringkan dengan tisu. Salah satu sisi kaca obyek dilewatkan pada nyala api spiritus brander. Dengan menggunakan kawat ose yang telah dipijar, diambil satu ose bakteri disuspensikan dengan air suling diatas kaca obyek tersebut. Selanjutnya preparat dilewatkan pada nyala api (difiksasi) yang bertujuan untuk mencegah terlepasnya preparat selama proses pewarnaan, kemudian preparat diberi keterangan. Lalu preparat ditetesi dengan larutan Crystal violet modifikasi Hucker, didiamkan selama satu menit, kemudian dicuci dengan air kran dan dikeringkan menggunakan tisu. Selanjutnya pada preparat diteteskan larutan Iodium Gram, didiamkan selama satu menit lalu dicuci dengan larutan alkohol aseton (7:3) hingga larutan alkohol aseton yang meninggalkan preparat tidak berwarna lagi. Preparat kemudian dibilas dengan air kran dan dikeringkan dengan tisu, kemudian dilakukan pengecatan dengan larutan Safranin Gram Stain, dan didiamkan selama setengah menit. Preparat dicuci kembali dengan air kran dan dikeringkan dengan tisu, kemudian diamati menggunakan mikroskop dengan bantuan minyak emersi (Bailey & Scott, 1974). c. uji fermentasi manitol Uji fermentasi manitol berguna untuk mengetahui kemampuan bakteri meragi manitol. Bakteri diinokulasikan pada media padat MSA yang telah ditambahkan indikator phenol red, kemudian diinkubasi pada 53 suhu 37ºC selama 24 jam. Hasil pengamatan positif, bila terdapat pertumbuhan koloni bakteri berwarna kuning dan adanya perubahan warna media dari merah menjadi kuning pada daerah di sekitar pertumbuhan koloni (Mac Faddin, 1980). d. uji katalase Uji katalase berguna untuk mengetahui adanya enzim katalase pada bakteri. Uji katalase ini digunakan untuk membedakan antara marga Staphylococcus dan Streptococcus, dimana Staphylococcus merupakan katalase positif yaitu menghasilkan enzim katalase, sedangkan Streptococcus merupakan katalase negatif yaitu tidak menghasilkan enzim katalase. Uji katalase dilakukan pada kaca obyek yang telah bebas dari debu dan lemak diteteskan larutan H2O2 3%, kemudian ditambahkan satu ose koloni bakteri uji, dan diamati ada tidaknya gelembung gas oksigen pada suspensi bakteri ke permukaan. Gelembung gas oksigen ini merupakan hasil peruraian H2O2 oleh enzim katalase menjadi H2O dan O2 (Mac Faddin, 1980; Jawetz et al., 1986). e. uji koagulase Uji koagulase berguna untuk mengetahui apakah Staphylococcus aureus menghasilkan enzim koagulase atau tidak. Diambil satu ose NaCl 0,9% steril dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah bebas dari debu dan lemak. Kemudian disuspensikan dengan satu ose koloni bakteri uji. Setelah itu, pada suspensi bakteri tersebut ditetesi satu ose plasma sitrat manusia atau kelinci. Hasil positif ditunjukkan dengan terjadinya aglutinasi dalam waktu kurang dari satu menit. 54 3.3.15. Pemeriksaan Bakteri Streptococcus mutans a. makroskopis Streptococcus mutans diinokulasi dengan penggoresan pada media TYC Agar dalam cawan petri, kemudian diinkubasi dalam wadah tertutup (toples) pada suhu 37ºC selama 24 jam. Kemudian koloni yang terpisah diamati secara makroskopis. Pengamatan makroskopis meliputi bentuk, warna, tepi, kenaikan permukaan, tekstur, dan ukuran koloni. Pada media TYC Agar, ciri-ciri koloni Streptococcus mutans adalah berbentuk bulat dengan diameter 1-2 mm, berwarna abu-abu sampai putih, tepi utuh, kenaikan permukaan melengkung, dan bertekstur opaque, mukoid dan halus, serta mempunyai konsistensi yang keras dan sangat melekat pada media TYC Agar. b. mikroskopis Dengan menggunakan pengecatan Gram, koloni diamati pada mikroskop. Pengamatan meliputi bentuk dan susunan sel, reaksi Gram serta ada atau tidaknya endospora. Streptococcus mutans memberikan warna ungu yang menunjukkan bakteri Gram positif berbentuk kokus yang tersusun dalam rantai 4-12 kokus dan tidak berspora (Bailey & Scott, 1974; Soerodjo, 1989; Talaro & Talaro, 1999; Brooks et al., 2001). Pengamatan secara mikroskopis untuk pengecatan Gram dilakukan sama seperti pada sub bab 3.3.14. bagian b. c. uji fermentasi Uji fermentasi terhadap Streptococcus mutans meliputi uji fermentasi manitol, sorbitol, laktosa, sukrosa, inulin, salisin, raffinosa, melibiosa, trehalosa, eskulin, dan arginin. Uji fermentasi tersebut dilakukan dengan cara satu ose koloni bakteri dimasukkan ke dalam masing-masing larutan uji fermentasi. Kemudian diinkubasi pada suhu 55 37ºC selama 24 jam. Hasil positif fermentasi tersebut menghasilkan asam dengan ditandai perubahan warna indikator BTB dari biru menjadi kuning karena indikator tersebut memberikan warna kuning pada suasana asam, warna biru pada suasana basa dan warna hijau pada suasana netral (Soerodjo, 1989). d. uji katalase Uji katalase berguna untuk mengetahui adanya enzim katalase pada bakteri. Uji katalase ini digunakan untuk membedakan antara marga Staphylococcus dan Streptococcus, dimana Staphylococcus merupakan katalase positif yaitu menghasilkan enzim katalase, sedangkan Streptococcus merupakan katalase negatif yaitu tidak menghasilkan enzim katalase, yang berarti Streptococcus mutans bukan termasuk golongan bakteri aerob. Uji katalase dilakukan dengan cara seperti yang tertulis pada pemeriksaan Staphylococcus aureus pada sub bab 3.3.14. bagian d. (Bailey & Scott, 1974; Talaro & Talaro, 1999). e. uji hemolisis Uji hemolisis dilakukan dengan cara menggoreskan satu ose koloni bakteri pada media agar darah. Kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Pada Streptococcus mutans yang melakukan hemolisis alfa, hasil hemolisisnya ditandai dengan terbentuknya daerah yang berwarna hijau di daerah sekitar koloni yang berarti Streptococcus mutans tidak menghemolisis darah manusia (Talaro & Talaro, 1999; Brooks et al., 2001). f. uji Voges Proskauer Uji Voges Proskauer ini dilakukan untuk menunjukkan kemampuan bakteri dalam menghasilkan Acetyl Methyl Carbinol (AMC) 56 dari hasil fermentasi glukosa. Kultur cair Streptococcus mutans diinokulasikan 2 ose pada 1 ml medium Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP) dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam, kemudian ditambah 0,6 ml larutan 0,5% alfa naftol dalam alkohol 95% dan 0,2 ml KOH 40%, lalu dikocok. Hasil positif ditandai dengan terjadinya warna merah, yang berarti terbentuk asetil metil karbinol dari fermentasi glukosa (Mac Faddin, 1980). g. uji kepekaan basitrasin Uji kepekaan basitrasin dilakukan dengan menyiapkan suspensi bakteri yang kekeruhannya setara dengan ½ Mc Farland I dan telah diencerkan 1000 kali. Kemudian cotton bud dicelupkan pada suspensi bakteri, lalu kapas ditekan pada sisi tabung agar tidak terlalu basah dan dioleskan pada permukaan agar darah secara merata dan dibiarkan cawan selama 5 menit. Selanjutnya, kertas cakram dicelupkan dalam larutan basitrasin (10 unit), kemudian diangkat dan dibiarkan sejenak agar tiris, selanjutnya kertas cakram diletakkan pada permukaan agar darah. Kertas cakram ditekan dengan pinset supaya menempel sempurna di permukaan agar darah, lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Kepekaan bakteri terhadap basitrasin ditandai dengan adanya Daerah Hambatan Pertumbuhan (DHP) di sekitar cakram dengan diameter ≥13 mm (dengan diameter ≤ 8 mm menunjukkan bahwa bakteri ini resisten dan 9-12 mm intermediate) (Lorian, 1991; Bauer, 1996). 3.3.16. Pembuatan Larutan ½ Mc Farland I Komposisi larutan Mc Farland I : Larutan BaCl2.2H2O 1% b/v 0,1 ml Larutan H2SO4 9,9 ml 1% v/v 57 Larutan ½ Mc Farland I dibuat dengan cara mengencerkan larutan Mc Farland I menjadi dua kali volume semula dengan media cair yaitu MHB untuk Staphylococcus aureus dan BHIB untuk Streptococcus mutans. Larutan ini digunakan sebagai pembanding untuk menentukan kekeruhan dari suspensi bakteri (Lorian, 1991). 3.3.17. Pembuatan Suspensi Bakteri Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus yang telah mencapai pertumbuhan optimal, berumur 24 jam pada media MSA miring dibuat suspensi pada media cair steril MHB sebanyak 2 ml dengan mengambil sedikit dari koloni mikroorganisme uji dengan kawat ose steril, kemudian diinokulasi pada media cair steril, dikocok perlahan sampai homogen, lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Dilakukan penyetaraan kekeruhan bakteri dengan larutan ½ Mc Farland I. Suspensi bakteri yang mempunyai kekeruhan setara dengan larutan ½ Mc Farland I diperkirakan memiliki populasi 1,5 x 108 cfu/ml. Kemudian suspensi bakteri tersebut diencerkan sebanyak 1000 kali sehingga didapatkan populasi bakteri ± 1,5 × 105 cfu/ml (Lorian, 1991). 3.3.18. Pembuatan Suspensi Bakteri Streptococcus mutans Kultur murni bakteri yang telah diremajakan dalam TYC Agar, diinokulasi satu ose ke dalam 2 ml BHIB dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Kultur bakteri dalam BHIB ini digunakan sebagai suspensi bakteri untuk pelaksanaan uji. Sebelum digunakan, kekeruhan suspensi bakteri disetarakan dengan larutan ½ Mc Farland I yang mempunyai populasi ± 1,5 × 108 cfu/ml. Kemudian suspensi bakteri tersebut diencerkan sebanyak 1000 kali sehingga didapatkan populasi bakteri ± 1,5 × 105 cfu/ml (Lorian, 1991). 58 3.3.19. Pembuatan Larutan Uji a. minyak atsiri daun cengkeh Minyak atsiri yang diperoleh dari destilasi Stahl ditimbang kemudian dilarutkan dengan DMSO sehingga diperoleh konsentrasi 10%, 20%, dan 30% (Antolis, 2004). b. air sisa destilasi daun cengkeh Air sisa destilasi yang digunakan diperoleh dari destilasi Stahl yang berasal dari labu dan buret. Dari air sisa destilasi labu dan buret masing-masing dibuat tanpa pengolahan, dipekatkan dengan water bath (WB) pada suhu ˂60°C hingga volume menjadi setengahnya dan freeze dried. Pada air sisa destilasi labu freeze dried dibuat konsentrasi sama seperti pada minyak atsiri yaitu 10%, 20%, dan 30%, sedangkan pada air sisa destilasi buret freeze dried dibuat konsentrasi 2%, 3%, dan 4%, karena hasil yang didapat pada labu freeze dryer tidak berupa serbuk kering, sehingga setelah labu ditimbang residu yang ada di dalam langsung dilarutkan dengan DMSO di dalam labu tersebut. 3.3.20. Pembuatan Larutan Pembanding Eugenol Eugenol dilarutkan dengan DMSO sehingga diperoleh konsentrasi 2%. 3.3.21. Penentuan Daya Antibakteri a. pelaksanaan metode difusi sumuran Disiapkan media MHA untuk Staphylococcus aureus sebanyak 30 ml dan 10 ml yang dicairkan terlebih dahulu dalam penangas air 100°C. Setelah mencair dipindahkan ke dalam penangas air 50°C dan didiamkan selama 10 menit, kemudian 30 ml media MHA 50°C dituang ke dalam cawan petri 15 cm, dirotasi dan dibiarkan sampai memadat (base layer). 59 Kemudian dipipet 0,1 ml suspensi bakteri yang telah disetarakan dengan larutan ½ Mc Farland I dan sudah diencerkan 1000x, lalu dimasukkan dalam 10 ml media MHA 50ºC dan dihomogenkan (seed layer), dan dituang serta disebar-ratakan pada permukaan base layer yang telah memadat. Setelah itu, dilakukan pra pengeraman selama 1,5-2 jam. Dibuat sumuran dengan perforator yang berdiameter 6 mm. Kemudian larutan uji minyak atsiri, air sisa destilasi labu dan buret serta larutan pembanding eugenol pada masing-masing konsentrasi yang telah dibuat dipipet 20 µl ke dalam sumuran pada tempat yang telah ditentukan. Kemudian diinkubasi suhu 37°C selama 24 jam. Setelah inkubasi, Daerah Hambatan Pertumbuhan (DHP) yang terbentuk di sekitar sumuran diukur diameternya dengan jangka sorong. Untuk Streptococcus mutans, cara pelaksanaan yang dilakukan sama seperti pada Staphylococcus aureus, tetapi menggunakan media yang berbeda yaitu TYC Agar. b. teknik analisis data Untuk melihat apakah ada perbedaan daya antibakteri yang bermakna antara minyak atsiri, air sisa destilasi labu, dan pembanding eugenol terhadap Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans, maka dilakukan perhitungan uji statistik One Way Anova yang menggunakan taraf signifikansi 5% dengan menggunakan program SPSS. Karena air sisa destilasi buret tidak memberikan DHP, maka tidak perlu dimasukkan dalam pengujian Anava dan secara langsung dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan daya antibakteri antara minyak atsiri, air sisa destilasi labu, dan pembanding eugenol dengan air sisa destilasi buret terhadap kedua bakteri uji. Hipotesis statistik dari penelitian untuk mengetahui adanya perbedaan daya antibakteri antara minyak atsiri, air sisa destilasi labu 60 daun cengkeh dan pembanding eugenol terhadap kedua bakteri uji adalah sebagai berikut: Ho = Tidak ada perbedaan bermakna antara daya antibakteri minyak atsiri, air sisa destilasi labu, dan pembanding eugenol terhadap Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans. Ha = Ada perbedaan bermakna antara daya antibakteri minyak atsiri, air sisa destilasi labu, dan pembanding eugenol terhadap Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans. Bila Ho ditolak dan Ha diterima yang dinyatakan dengan P < 0,05 maka dilanjutkan dengan uji HSD (taraf signifikansi 5%), dimana dihitung selisih 2 mean dari data DHP bakteri antara minyak atsiri (berbagai konsentrasi), pembanding eugenol dan air sisa destilasi labu (dengan berbagai perlakuan dan konsentrasi). Bila selisih harga dua mean lebih besar dari harga HSD 5% maka terdapat perbedaan yang bermakna. Selain itu, untuk melihat apakah ada perbedaan yang bermakna daya antibakteri minyak atsiri (semua konsentrasi), air sisa destilasi labu (semua perlakuan dan konsentrasi), dan pembanding eugenol antara Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans, maka dilakukan juga perhitungan uji statistik One Way Anova yang menggunakan taraf signifikansi 5% dengan bantuan program SPSS. Pada uji Anava hipotesisnya adalah sebagai berikut: Ho = Tidak ada perbedaan bermakna daya antibakteri minyak atsiri (semua konsentrasi), air sisa destilasi labu (semua perlakuan dan konsentrasi), dan pembanding eugenol antara Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans. Ha = Ada perbedaan bermakna daya antibakteri minyak atsiri (semua konsentrasi), air sisa destilasi labu (semua perlakuan dan konsentrasi), dan pembanding eugenol antara Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans. 61 Bila P < 0,05 maka Ho ditolak dan Ha diterima. 3.3.22. Pelaksanaan Metode Dilusi a. penentuan efek bakteriostatik (KHM) Dimethyl Sulfoxide (DMSO) DMSO merupakan pelarut yang digunakan untuk melarutkan minyak atsiri dan eugenol pada metode dilusi. DMSO ini mempunyai efek bakteriosatik yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri (The Pharmaceutical Society of Great Britain, 1982) dan untuk mengetahuinya, maka terlebih dahulu dilakukan penentuan KHM dari DMSO. Konsentrasi DMSO yang digunakan untuk melarutkan minyak atsiri dan eugenol dipilih di bawah nilai KHM, sehingga DMSO tidak menghambat pertumbuhan bakteri uji dan dapat melarutkan minyak atsiri dan eugenol. Dibuat larutan uji dari DMSO untuk Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans pada konsentrasi 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% dan 70%. Masing-masing dibuat dalam tabung reaksi, lalu ditambah dengan media MHB untuk Staphylococcus aureus dan media BHIB untuk Streptococcus mutans, kemudian dari masing-masing tabung ditambahkan 0,5 ml suspensi bakteri yang telah disetarakan dengan larutan ½ Mc Farland I dan sudah diencerkan 1000x, lalu diinkubasi selama 24 jam suhu 37°C. Setelah inkubasi masing-masing inokulum dituang ke dalam cawan petri steril dan ditambahkan media MHA untuk Staphylococcus aureus dan media TYC Agar untuk Streptococcus mutans sebanyak 10 ml yang telah dicairkan dan didinginkan pada suhu 50°C, kemudian disebar-ratakan dan dibiarkan memadat, kemudian diinkubasi selama 24 jam suhu 37°C. Selain itu, dibuat juga blanko positif dan negatif untuk masing-masing bakteri. Blanko positif terdiri dari 0,5 ml media cair dan ditambahkan 0,5 ml suspensi bakteri yang telah disetarakan dengan larutan ½ Mc Farland I dan sudah diencerkan 1000x, 62 sedangkan blanko negatif hanya berisi 1 ml media cair tanpa suspensi bakteri. Blanko positif ini digunakan untuk membandingkan hasil pertumbuhan bakteri pada konsentrasi tertentu dimana bakeri masih dapat tumbuh. Kemudian ditentukan KHM yaitu konsentrasi terendah dari DMSO yang menghambat pertumbuhan bakteri uji. b. penentuan efek bakteriostatik (KHM) dari pembanding eugenol dan minyak atsiri daun cengkeh dengan metode dilusi cair yang dimodifikasi Pada metode dilusi cair ini konsentrasi larutan uji minyak atsiri pada kedua bakteri dibuat berbeda. Hal ini berdasarkan pada penelitian terdahulu oleh Prabuseenivasan et al., (2006) dari minyak cengkeh dengan metode dilusi terhadap berbagai bakteri, tetapi pada penelitian ini konsentrasinya telah dimodifikasi. Untuk Staphylococcus aureus dibuat larutan uji minyak atsiri dengan kisaran konsentrasi 0,16%, 0,17%, 0,18%, 0,19%, 0,20%, 0,21%, 0,22%, 0,23%, 0,24% dan 0,25% yang dibuat dalam tabung reaksi dengan melarutkan minyak atsiri dengan DMSO masing-masing sebanyak 2,5 ml, lalu ditambah dengan media MHB sampai volume 10 ml dan dihomogenkan. Kemudian larutan uji dipipet 0,5 ml ke tabung reaksi kecil dan ditambahkan 0,5 ml suspensi bakteri, lalu diinkubasi selama 24 jam suhu 37°C. Setelah inkubasi masing-masing inokulum dituang ke dalam cawan petri steril dan dituang media MHA 10 ml yang telah dicairkan dan didinginkan pada suhu 50°C, kemudian disebar-ratakan dan dibiarkan memadat, lalu diinkubasi selama 24 jam suhu 37°C. Tentukan KHMnya yaitu konsentrasi terendah dari minyak atsiri yang menghambat pertumbuhan bakteri uji. Untuk Streptococcus mutans dibuat larutan uji dengan kisaran konsentrasi 0,26%, 0,27%, 0,28%, 0,29%, 0,30%, 0,31%, 0,31%, 0,33%, 0,34% dan 0,35% yang mana proses pengerjaannya sama seperti 63 Staphylococcus aureus hanya berbeda pada media yang digunakan yaitu untuk media cair digunakan BHIB dan media padat digunakan TYC Agar. Sedangkan untuk pembanding eugenol, konsentrasi yang dibuat berdasarkan pada penelitian oleh Leite et al., (2007), tetapi pada penelitian ini konsentrasi yang digunakan telah dimodifikasi. Untuk larutan uji pembanding eugenol dibuat konsentrasi 0,10%, 0,15%, 0,20%, 0,25%, 0,30%, 0,35% dan 0,40% untuk Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans. Selanjutnya cara pengerjaan dan media yang digunakan pada masing-masing bakteri sama seperti pada pembuatan larutan uji minyak atsiri. Uji ini dilengkapi dengan kontrol positif dan negatif untuk masingmasing bakteri. Kontrol positif terdiri dari 125µl DMSO ditambah 375µl media cair MHB untuk Staphylococcus aureus dan media BHIB untuk Streptococcus mutans dan ditambah 0,5 ml suspensi bakteri yang telah disetarakan dengan larutan ½ Mc Farland I yang sudah diencerkan 1000x, sedangkan kontrol negatif hanya terdiri dari 250µl DMSO dan 750µl media cair tanpa suspensi bakteri. c. penentuan efek bakteriostatik (KHM) dari air sisa destilasi labu daun cengkeh tanpa pengolahan dengan metode dilusi cair yang dimodifikasi Pada penelitian ini, untuk air sisa destilasi labu semua konsentrasi yang digunakan diperoleh berdasarkan hasil orientasi baik pada Staphylococus aureus maupun Streptococcus mutans. Untuk larutan uji air sisa destilasi labu daun cengkeh tanpa pengolahan untuk Staphylococus aureus dibuat konsentrasi 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% dan 25%. Larutan uji dibuat di dalam tabung reaksi dengan melarutkan air sisa destilasi labu tanpa pengolahan dengan 64 aquadest steril, kemudian pada masing-masing larutan uji ditambah 0,25 ml media MHB, kemudian masing-masing ditambah 0,5 ml suspensi bakteri, lalu diinkubasi selama 24 jam suhu 37°C. Setelah inkubasi masing-masing inokulum dituang ke dalam cawan petri steril dan dituang media MHA sebanyak 10 ml yang telah dicairkan dan didinginkan pada suhu 50°C, kemudian dirotasi sampai merata dan dibiarkan memadat, lalu diinkubasi selama 24 jam suhu 37°C. Tentukan KHMnya yaitu konsentrasi terendah dari air sisa destilasi labu daun cengkeh tanpa pengolahan yang menghambat pertumbuhan bakteri uji. Untuk Streptococcus mutans dibuat konsentrasi 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% dan 20% dari air sisa destilasi labu tanpa pengolahan. Selanjutnya pengerjaannya sama seperti pada Staphylococus aureus hanya berbeda pada media yang digunakan yaitu untuk media cair Streptococcus mutans digunakan BHIB dan media padat digunakan TYC Agar. Kemudian, dibuat larutan kontrol positif dan negatif terhadap kedua bakteri uji untuk membandingkan ada atau tidak ada pertumbuhan bakteri pada penentuan KHM. Kontrol positif berisi 0,25 ml aquadest steril + 0,25 ml media cair + 0,5 ml suspensi bakteri dan kontrol negatif berisi 0,75 ml aquadest steril + 0,25 ml media cair. d. penentuan efek bakteriostatik (KHM) dari air sisa destilasi labu daun cengkeh yang dipekatkan dengan water bath (wb) dengan metode dilusi cair yang dimodifikasi Untuk larutan uji air sisa destilasi labu yang dipekatkan dengan WB suhu ˂60ºC untuk Staphylococus aureus dan Streptococcus mutans dibuat kisaran konsentrasi sama yaitu 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% dan 15%. Selanjutnya, cara pengerjaan dan media yang digunakan pada masing-masing bakteri sama seperti pada sub bab 3.3.22. bagian c. Kemudian tentukan KHM yaitu konsentrasi terendah dari air 65 sisa destilasi labu daun cengkeh yang dipekatkan dengan WB suhu ˂60ºC yang menghambat pertumbuhan bakteri uji. Dibuat juga larutan kontrol positif dan negatif yang sama seperti pada sub bab 3.3.22. bagian c. untuk membandingkan ada atau tidak ada pertumbuhan bakteri pada penentuan KHM. e. penentuan efek bakteriostatik (KHM) dari air sisa destilasi labu daun cengkeh freeze dried dengan metode dilusi cair Larutan uji air sisa destilasi labu freeze dried terhadap Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans dibuat pada kisaran konsentrasi 0,30%, 0,35%, 0,40%, 0,45%, 0,50%, 0,55%, 0,60%, 0,65%, 0,70% dan 0,75% dengan terlebih dahulu dibuat larutan induk dengan konsentrasi 15%. Kemudian masing-masing dibuat di dalam tabung reaksi dengan melarutkan air sisa destilasi labu freeze dried dengan aquadest steril. Lalu dari masing-masing tabung diambil 0,25 ml dan ditambah 0,25 ml media MHB untuk Staphylococcus aureus dan media BHIB untuk Streptococcus mutans, setelah itu masing-masing ditambah 0,5 ml suspensi bakteri, dan diinkubasi selama 24 jam suhu 37°C. Tentukan KHM yaitu konsentrasi terendah dari air sisa destilasi labu freeze dried yang menghambat pertumbuhann bakteri uji. Dibuat juga larutan kontrol positif dan negatif yang sama seperti pada sub bab 3.3.22. bagian c. untuk digunakan sebagai pembanding pada penentuan KHM. 66 3.4. Skema Kerja 3.4.1. Isolasi Minyak Atsiri dan Air Sisa Destilasi Daun Cengkeh Daun Cengkeh Segar - Pencucian dan sortasi bahan Pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis Pembuatan serbuk, karakterisasi serbuk dan skrining fitokimia Destilasi Stahl Minyak Atsiri Air Sisa Destilasi Ditambah Na2SO4 Minyak Atsiri Bebas Air Analisis: - Organoleptis - Fisika & Kimia - KLT Buret dan labu: - Tanpa pengolahan - Dipekatkan di WB suhu <60ºC - Freeze dried Analisis: - Organoleptis - KLT 67 3.4.2. Daya Antibakteri dengan Metode Difusi Sumuran terhadap Bakteri Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans Minyak Atsiri Air Sisa Destilasi Eugenol 2% DMSO Pipet 20µl Masing-masing dimasukkan ke dalam sumuran pada lempeng agar overlay media MHA untuk Staphylococcus aureus dan TYC Agar untuk Streptococcus mutans yang telah diinokulasi bakteri MA2 MA1 MA3 KP ASDL 1 MA3 MA2 MA1 ASDB 1 KP ASDL 2 KN ASDB 2 KN ASDL3 ASDL5 ASDL 4 ASDB3 ASDB5 ASDB 4 Diinkubasi suhu 37° C selama 24 jam DHP yang terbentuk di sekitar sumuran diukur diameternya dengan jangka sorong Keterangan : MA1 MA2 MA3 ASDL1 ASDL2 ASDL3 ASDL4 ASDL5 ASDB1 ASDB2 ASDB3 ASDB4 ASDB5 KP KN : Minyak atsiri 10% : Minyak atsiri 20% : Minyak atsiri 30% : Air sisa destilasi labu tanpa pengolahan : Air sisa destilasi labu dipekatkan dalam WB suhu ˂60°C : Air sisa destilasi labu freeze dried, dibuat konsentrasi 10% : Air sisa destilasi labu freeze dried, dibuat konsentrasi 20% : Air sisa destilasi labu freeze dried, dibuat konsentrasi 30% : Air sisa destilasi buret tanpa pengolahan : Air sisa destilasi buret pekat dalam WB suhu ˂60°C : Air sisa destilasi buret freeze dried, dibuat konsentrasi 2% : Air sisa destilasi buret freeze dried, dibuat konsentrasi 3% : Air sisa destilasi buret freeze dried, dibuat konsentrasi 4% : Eugenol 2% : DMSO 68 3.4.3. 10% Penentuan Efek Bakteriostatik (KHM) Dimethyl Sulfoxide (DMSO) terhadap Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans dengan Metode Dilusi Cair yang Dimodifikasi 20% 30% 40% 50% 60% 70% BL + BL - Masing-masing ditambah 0,5 ml suspensi bakteri Blanko + Blanko - Blanko + Blanko - Inkubasi suhu 37ºC selama 24 jam 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% BL + BL - Ditambahkan 10 ml media padat MHA untuk Staphylococcus aureus dan media TYC agar untuk Streptococcus mutans yang telah dicairkan dan didinginkan suhu 50°C 10 menit Inkubasi suhu 37°C selama 24 jam Tentukan KHM yaitu konsentrasi terendah dari DMSO yang menghambat pertumbuhan bakteri uji Keterangan : 10% : 50µl DMSO + 450µl media cair 20%: 100µl DMSO + 400µl media cair 30%: 150µl DMSO + 350µl media cai 40%: 200µl DMSO + 300µl media cair 50%: 250µl DMSO + 250µl media cair 60%: 300µl DMSO + 200µl media cair 70%: 350µl DMSO + 150µl media cair BL + (blanko positif) : 0,5 ml media cair + 0,5 ml suspensi bakteri BL – (blanko negatif) : 1 ml media cair Media cair : MHB untuk Staphylococcus aureus dan BHIB untuk Streptococcus mutans 69 3.4.4. Daya Antibakteri dengan Metode Dilusi a. penentuan KHM pembanding eugenol terhadap Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans dengan metode dilusi cair yang dimodifikasi 0,10% 0,15% 0,20% 0,25% 0,30% 0,35% 0,40% KP KN Kontrol positif Masing-masing diambil 0,5 ml + 0,5 ml suspensi bakteri Kontrol negatif Inkubasi suhu 37ºC selama 24 jam Blanko + 0,10% 0,15% 0,20% 0,25% 0,30% 0,35% 0,40% KP KN Ditambahkan 10 ml media padat MHA untuk Staphylococcus aureus dan media TYC Agar untuk Streptococcus mutans yang telah dicairkan dan didinginkan suhu 50°C 10 menit Inkubasi suhu 37°C selama 24 jam Tentukan KHM yaitu konsentrasi terendah dari pembanding eugenol yang menghambat pertumbuhan bakteri uji Keterangan : 0,10% : 10µl eugenol + 2,5ml DMSO + 7,490ml media cair 0,15% : 15µl eugenol + 2,5ml DMSO + 7,485ml media cair 0,20% : 20µl eugenol + 2,5ml DMSO + 7,480ml media cair 0,25% : 25µl eugenol + 2,5ml DMSO + 7,475ml media cair 0,30% : 30µl eugenol + 2,5ml DMSO + 7,470ml media cair 0,35% : 35µl eugenol + 2,5ml DMSO + 7,465ml media cair 0,40% : 40µl eugenol + 2,5ml DMSO + 7,460ml media cair KP (Kontrol Positif) : 125µl DMSO + 375µl media cair + 0,5 ml suspensi bakteri KN (Kontrol Negatif) : 250µl DMSO + 750µl media cair Blanko - 70 b. penentuan KHM minyak atsiri daun cengkeh terhadap Staphylococcus aureus dengan metode dilusi cair yang dimodifikasi 0,22% 0,23% 0,24% 0,25% 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,21% 0,5 ml 0,5 ml 0,20% 0,5 ml 0,5 ml 0,19% 0,5 ml 0,18% 0,5 ml 0,17% 0,5 ml 0,16% Masing-masing ditambah 0,5 ml suspensi bakteri Inkubasi suhu 37ºC selama 24 jam 0,16% 0,17% 0,18% 0,19% 0,20% 0,21% 0,22% 0,23% 0,24% Ditambahkan 10 ml media padat MHA yang telah dicairkan dan didinginkan suhu 50°C 10 menit Inkubasi suhu 37°C selama 24 jam Tentukan KHM yaitu konsentrasi terendah dari minyak atsiri yang menghambat pertumbuhan bakteri uji Keterangan : 0,16% : 16µl MA + 2,5ml DMSO + 7,484ml MHB 0,17% : 17µl MA + 2,5ml DMSO + 7,483ml MHB 0,18% : 18µl MA + 2,5ml DMSO + 7,482ml MHB 0,19% : 19µl MA + 2,5ml DMSO + 7,481ml MHB 0,20% : 20µl MA + 2,5ml DMSO + 7,480ml MHB 0,21% : 21µl MA + 2,5ml DMSO + 7,479ml MHB 0,22% : 22µl MA + 2,5ml DMSO + 7,478ml MHB 0,23% : 23µl MA + 2,5ml DMSO + 7,477ml MHB 0,24% : 24 µl MA + 2,5ml DMSO + 7,476ml MHB 0,25% : 25 µl MA + 2,5ml DMSO + 7,475ml MHB * Dibuat juga larutan KP dan KN seperti pada sub bab 3.4.4. bagian a. 0,25% 71 c. penentuan KHM minyak atsiri daun cengkeh terhadap Streptococcus mutans dengan metode dilusi cair yang dimodifikasi 0,32% 0,33% 0,34% 0,35% 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,31% 0,5 ml 0,5 ml 0,30% 0,5 ml 0,5 ml 0,29% 0,5 ml 0,28% 0,5 ml 0,27% 0,5 ml 0,26% 0,34% 0,35% Masing-masing ditambah 0,5 ml suspensi bakteri Inkubasi suhu 37ºC selama 24 jam 0,26% 0,27% 0,28% 0,29% 0,30% 0,31% 0,32% 0,33% Ditambahkan 10 ml media padat TYC Agar yang telah dicairkan dan didinginkan suhu 50°C 10 menit Inkubasi suhu 37°C selama 24 jam Tentukan KHM yaitu konsentrasi terendah dari minyak atsiri yang menghambat pertumbuhan bakteri uji Keterangan : 0,26% : 26µl MA + 2,5ml DMSO + 7,474ml BHIB 0,27% : 27µl MA + 2,5ml DMSO + 7,473ml BHIB 0,28% : 28µl MA + 2,5ml DMSO + 7,472ml BHIB 0,29% : 29µl MA + 2,5ml DMSO + 7,471ml BHIB 0,30% : 30µl MA + 2,5ml DMSO + 7,470ml BHIB 0,31% : 31µl MA + 2,5ml DMSO + 7,469ml BHIB 0,32% : 32µl MA + 2,5ml DMSO + 7,468ml BHIB 0,33% : 33µl MA + 2,5ml DMSO + 7,467ml BHIB 0,34% : 34 µl MA + 2,5ml DMSO + 7,466ml BHIB 0,35% : 35 µl MA + 2,5ml DMSO + 7,465ml BHIB * Dibuat juga larutan KP dan KN seperti pada sub bab 3.4.4. bagian a. 72 d. penentuan KHM air sisa destilasi labu daun cengkeh tanpa pengolahan terhadap Staphylococcus aureus dengan metode dilusi cair yang dimodifikasi 16% 17% 18% 19% 20% 21% 22% 23% 24% 25% Masing-masing ditambah 0,25 ml MHB + 0,5 ml suspensi bakteri Inkubasi suhu 37ºC selama 24 jam 16% 17% 18% 19% 20% 21% 22% 23% 24% 25% Ditambahkan 10 ml media padat MHA yang telah dicairkan dan didinginkan suhu 50°C 10 menit Inkubasi suhu 37°C selama 24 jam Tentukan KHM yaitu konsentrasi terendah dari air sisa destilasi labu tanpa pengolahan yang menghambat pertumbuhan bakteri uji Keterangan : 16% : 80µl ASDL tanpa pengolahan + 170µl aquadest steril 17% : 85µl ASDL tanpa pengolahan + 165µl aquadest steril 18% : 90µl ASDL tanpa pengolahan + 160µl aquadest steril 19% : 95µl ASDL tanpa pengolahan + 155µl aquadest steril 20% : 100µl ASDL tanpa pengolahan + 150µl aquadest steril 21% : 105µl ASDL tanpa pengolahan + 145µl aquadest steril 22% : 110µl ASDL tanpa pengolahan + 140µl aquadest steril 23% : 115µl ASDL tanpa pengolahan + 135µl aquadest steril 24% : 120µl ASDL tanpa pengolahan + 130µl aquadest steril 25% : 125µl ASDL tanpa pengolahan + 125µl aquadest steril * Dibuat juga larutan kontrol positif (0,25 ml aquadest steril + 0,25 ml MHB + 0,5 ml suspensi bakteri) dan kontrol negatif (0,75ml aquadest steril + 0,25 ml MHB) 73 e. penentuan KHM air sisa destilasi labu daun cengkeh tanpa pengolahan terhadap Streptococcus mutans dengan metode dilusi cair yang dimodifikasi 11% 12% 13% 14% 15% 16% 17% 18% 20% 19% Masing-masing ditambah 0,25 ml BHIB + 0,5 ml suspensi bakteri Inkubasi suhu 37ºC selama 24 jam 11% 12% 13% 14% 15% 16% 17% 18% 19% 20% Ditambahkan 10 ml media padat TYC Agar yang telah dicairkan dan didinginkan suhu 50°C 10 menit Inkubasi suhu 37°C selama 24 jam Tentukan KHM yaitu konsentrasi terendah dari air sisa destilasi labu tanpa pengolahan yang menghambat pertumbuhan bakteri uji Keterangan : 11% : 55µl ASDL tanpa pengolahan + 195µl aquadest steril 12% : 60µl ASDL tanpa pengolahan + 190µl aquadest steril 13% : 65µl ASDL tanpa pengolahan + 185µl aquadest steril 14% : 70µl ASDL tanpa pengolahan + 180µl aquadest steril 15% : 75µl ASDL tanpa pengolahan + 175µl aquadest steril 16% : 80µl ASDL tanpa pengolahan + 170µl aquadest steril 17% : 85µl ASDL tanpa pengolahan + 165µl aquadest steril 18% : 90µl ASDL tanpa pengolahan + 160µl aquadest steril 19% : 95µl ASDL tanpa pengolahan + 155µl aquadest steril 20% : 100µl ASDL tanpa pengolahan + 150µl aquadest steril * Dibuat juga larutan kontrol positif (0,25 ml aquadest steril + 0,25 ml BHIB + 0,5 ml suspensi bakteri) dan kontrol negatif (0,75ml aquadest steril + 0,25 ml BHIB) 74 f. penentuan KHM air sisa destilasi labu daun cengkeh yang dipekatkan dengan water bath (wb) terhadap Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans dengan metode dilusi cair yang dimodifikasi 6% 7% 8% 9% 10% 11% 12% 13% 14% 15% Masing-masing ditambah 0,25 ml MHB untuk S.aureus dan BHIB untuk S.mutans + 0,5 ml suspensi bakteri Inkubasi suhu 37ºC selama 24 jam 11% 12% 13% 14% 15% 16% 17% 18% 19% 20% Ditambahkan 10 ml media padat MHA untuk S.aureus dan TYC Agar untuk S.mutans yang telah dicairkan dan didinginkan suhu 50°C 10 menit Inkubasi suhu 37°C selama 24 jam Tentukan KHM yaitu konsentrasi terendah dari air sisa destilasi labu yang dipekatkan dengan WB yang menghambat pertumbuhan bakteri uji Keterangan : 6% : 30µl ASDL tanpa pengolahan + 220µl aquadest steril 7% : 35µl ASDL tanpa pengolahan + 215µl aquadest steril 8% : 40µl ASDL tanpa pengolahan + 210µl aquadest steril 9% : 45µl ASDL tanpa pengolahan + 205µl aquadest steril 10% : 50µl ASDL tanpa pengolahan + 200µl aquadest steril 11% : 55µl ASDL tanpa pengolahan + 195µl aquadest steril 12% : 60µl ASDL tanpa pengolahan + 190µl aquadest steril 13% : 65µl ASDL tanpa pengolahan + 185µl aquadest steril 14% : 70µl ASDL tanpa pengolahan + 180µl aquadest steril 15% : 75µl ASDL tanpa pengolahan + 175µl aquadest steril * Dibuat juga larutan kontrol positif dan negatif dan dilakukan seperti pada sub bab 3.4.4. bagian d. untuk Staphylococcus aureus dan sub bab 3.4.4. bagian e. untuk Streptococcus mutans. 75 g. penentuan KHM air sisa destilasi labu daun cengkeh freeze dried terhadap Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans dengan metode dilusi cair 0,50% 0,55% 0,60% 0,65% 0,70% 0,25 ml 0,25 ml 0,25 ml 0,25 ml 0,75% 0,25 ml 0,45% 0,25 ml 0,25 ml 0,25 ml 0,40% 0,25 ml 0,35% 0,25 ml 0,30% Masing-masing ditambah 0,25 ml MHB untuk S.aureus dan BHIB untuk S.mutans + 0,5 ml suspensi bakteri Inkubasi suhu 37ºC selama 24 jam Tentukan KHM yaitu konsentrasi terendah dari air sisa destilasi freeze dried yang menghambat pertumbuhan bakteri uji Keterangan : 0,30% : 40µl ASDL freeze dried 15% + 960µl aquadest steril 0,35% : 140µl ASDL freeze dried 15% + 2,860ml aquadest steril 0,40% : 160µl ASDL freeze dried 15% + 2,840ml aquadest steril 0,45% : 60µl ASDL freeze dried 15% + 940µl aquadest steril 0,50% : 200µl ASDL freeze dried 15% + 2,800ml aquadest steril 0,55% : 220µl ASDL freeze dried 15% + 2,780ml aquadest steril 0,60% : 80µl ASDL freeze dried 15% + 920µl aquadest steril 0,65% : 260µl ASDL freeze dried 15% + 2,740ml aquadest steril 0,70% : 280µl ASDL freeze dried 15% + 2,720ml aquadest steril 0,75% : 100µl ASDL freeze dried 15% + 900µl aquadest steril *Dibuat larutan ASDL 15% = ditimbang serbuk hasil ASDL daun cengkeh freeze dried 0,45 gram + 3000µl aquadest steril. *Dibuat juga larutan kontrol positif dan negatif dan dilakukan seperti pada sub bab 3.4.4. bagian d. untuk Staphylococcus aureus dan sub bab 3.4.4. bagian e. untuk Streptococcus mutans.

Judul: Jurnal Bab 3

Oleh: Aprovta Mess


Ikuti kami