Deteksi Virus Dengan Teknik Pcr

Oleh Fannoka Rijoly

166,5 KB 9 tayangan 0 unduhan
 
Bagikan artikel

Transkrip Deteksi Virus Dengan Teknik Pcr

Laporan Praktikum ke- 11 m.k. Mikrobiologi Akuakultur Hari/Tanggal : Minggu, 14 Desember 2014 Kelompok : IV Asisten : 1. Rahman, S.Pi., M.Si 2. Asisten Mikro 2013 DETEKSI VIRUS DENGAN TEKNIK PCR: Oleh: Stefanno. M. A. Rijoly C151140401 ILMU AKUAKULTUR SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2014 I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Koi Herpes Virus (KHV) atau Virus Herpes pada ikan koi merupakan penyakit yang mudah menular pada berbagai jenis ikan termasuk koi dan keluarga karper. Kematian ikan yang disebabkan Virus Herpes bisa mencapai 20% sampai dengan 100%. Virus ini biasa menyebar pada musim panas saat suhu air cukup tinggi, antara suhu 18 - 27˚C. Kematian yang disebabkan Virus Herpes ini termasuk cepat hanya dalam waktu 24 -48 jam sejak ada gejala. Kematian ikan koi yang disebabkan oleh Virus Herpes termasuk sporadis, karena kematian dalam jumlah yang besar (Hendrick, 2000). KHV juga dikenal sebagai Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV3) yang tergolong virus double-standed DNA dan termasuk dalam family Alloherpesviridae. KHV menyerang beragam usia dan sering mengakibatkan 80-100% kematian ketika temperatur air berkisar antara 16°C25°C (Haenen et al., 2004). Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam (Handoyo dan Rudiretna, 2001). Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: pra-denaturasi DNA templat, denaturasi DNA templat, penempelan primer pada templat (annealing), pemanjangan primer (extension) dan pemantapan (post extension). Tahap denaturasi sampai dengan tahap pemanjangan primer merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA (Sulistyaningsih, 2007). 1.2 Tujuan Praktikum ini bertujuan mendeteksi secara molekular organisme uji apakah negatif atau positif terserang Koi herves Virus (KHV) dengan menggunakan teknik Polimerase Chain Reaction (PCR). Page | 112 II. METODOLOGI 2.1 Waktu dan Tempat Paraktikum ini dilaksanakan pada hari Minggu, 14 Desember 2014 pukul 10.00-14.00 WIB, bertempat di Laboratorium Molekular Ikan dan Bioteknologi, Depertemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. 2.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah mortar, pipet mikro, tabung mikro, tipe, sentrifuse, thermoshaker, lemari es, rak tabung mikro. Sedangkan bahan yang digunakan adalah sampel insang ikan, aqudest, cell lysis solution, proteinase K, RNAse, protein precipitation solution, isopropanol, ETOH 70%, KAPA mix, foward, reserver, IEW. 2.3 Prosedur Kerja 2.3.1 Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA merupakan tahap awal dalam teknik PCR. Tujuan dari tahap ini adalah mendapatkan DNA dari sel utuh. Ekstraksi DNA melalui tahap pelisisan sel dan pemisahan DNA dari materi sel lainnya. 2.3.1.1 Sel Lisis Sampel insang diambil 100 mg. Jumlah sampel terkadang juga bergantung pada kit yang digunakan. Sampel ditambahkan sedikit aquades dan digerus dengan mortar. Setelah halus, sampel dipindahkan di tabung mikro/ependof. Cell lysis solution 200 µl ditambahkan pada ependof dan divorteks. Kemudian ditambahkan 1,5 µl proteinase K dan divorteks ulang. Ependof diinkubasi pada thermoshake pada suhu 55°C selama 3 jam hingga sel lisis. 2.3.1.2 RNAase Treatment dan Protein Precipitation Ependof hasil inkubasi ditambahkan 1,5 µl RNAase dan divorteks sampai homogen. Kemudian diinkubasi pada thermoshaker pada suhu 37 °C selama 30 menit. Setelah diinkubasi ditambahkan dengan 50 µl protein precipitation solution. Ependof diinkubasi on ice selama 10-15 menit atau 5-10 menit pada Page | 113 suhu -20°C. Setelah diinkubasi kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Mikrotube baru diambil dan diisi dengan 300 µl isopropanol. Mikrotube yang berisi sampel hasil sentrifugasi diambil supernatan dengan pipet mikro yaitu lapisan bening bagian atas. Supernatan dicampur pada ependof berisi isopropanol dan divorteks sampai homogen. Ependof disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Hasil sentrifugasi yaitu pada dinding dasar mikrotube terdapat bercak putih yang merupakan DNA sampel. Supernatan dibuang hingga tersisa DNA sampel. Untuk memurnikan, DNA dicuci dengan ETOH 70% sebanyak 300 µl dan divorteks kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit. Setelah disentrifugasi ETOH dibuang dan tabung dibalik untuk dikering-anginkan. 2.3.2 Ampifikasi DNA dengan PCR Disiapkan premix sampel uji, kontrol positif, dan kontrol negatif. Kemudisan didistribusikan 9 µl premix kedalam setiap tabung PCR yang jumlahnya sesuai dengan jumlah sampel. Lalu ditambahkan 1 µl DNA sampel dan divortex. Kemudian diatur alat thermal cycler dengan kondisi PCR sebagai berikut: Pre Denaturation 94oC selama 3 menit; denaturasi 94oC selama 30 detik, Annealing primer 57oC selama 30 detik sebanyak 35 siklus, Extention 72 oC selama 30 menit; Final Extention 72oC 3 menit. Selanjutnya, suhu diturunkan dan diakhiri pada 4oC. 2.3.3 Visualisasi Elektroforesis Hasil PCR akan divisualisasikan pada gel agarose. Tahapan pembuatan gel agarose yaitu, dipersiapkan serbuk agarose dan dilarutkan dalam TBE (Tris Base, Boric Acid, EDTA) yang mengandung 0,01 g/mL ethidium bromida, kemudian dipanaskan dalam microwave selama 1,5 menit sampai larutan menjadi bening. Setelah hangat, larutan dituangkan ke dalam cetakan yang telah dilengkapi sisir (comb) sebagai cetakan sumur (well) elektroforesis. Setelah membeku, sisir dilepas secara perlahan, gel dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang telah berisi larutan buffer TBE. Lalu dicampur 5 µl sampel DNA produk PCR dengan dengan 0,5 µL loading dye lalu dimasukkan ke dalam sumur gel dengan menggunakan mikropipet. Marker DNA selanjutnya juga dimasukkan sebanyak 1- Page | 114 2 µL. Bak elektroforesis kemudian ditutup dan dihidupkan power supply. Kemudian dimatikan power supply ketika sampel DNA sudah bermigrasi (ditandai dengan warna loading dye yang mencapai sekitar ¾ dari total panjang gel agarose) tau sesuai yang diinginkan. Langkah terakhir, hasil uji KHV dilihat dan dibandingkan dengan kedua kontrol dan standar ukuran DNA dibawah cahaya UV dan didokumentasikan Page | 115 III. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Hasil Berikut adalah hasil visualisasi eletroforesis dengan sinar UV. M A C - 300 kb 100 kb + Keterangan M : Marker (KAPPA® DNA Ladder) A : Sample A C : Sample C - : Sample ikan - KHV + : Plasmid Glikoprotein KHV Gambar 1. band yang ditunjukkan oleh hasil elektroforesis 3.2 Pembahasan Diagnosa penyakit menggunakan teknik PCR telah banyak dikembangkan pada akhir-akhir ini PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler. DNA murni virus dengan jumlah memadai dapat diperoleh dengan cara mengisolasi DNA dari inang kemudian mengamplifikasinya (Muladno, 2002) Banyak cara dan berbagai macam prosedur yang dapat dilakukan dalam upaya deteksi virus KHV, tergantung pada reagen dan kit yang digunakan baik pada tahap ekstraksi, purifikasi, amplifikasi, maupun elektrophoresis. Gomez et al., (2011) menggunakan Qiagen GmbH Dneasy Tissue extraction kit (Qiagen, Germany). Mesin PCR yang digunakan adalah real-time PCR assays 2.5 dengan primer KHV didesain pada wilayah 9/5 dan wilayah target yaitu 484 pasang basa. Page | 116 Proses PCR diawali dengan kegiatan isolasi DNA. Isolasi DNA merupakan tahap yang paling penting untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi yang merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler. Pada dasarnya isolasi DNA genom total dari sel bakteri terdiri dari beberapa tahap yaitu: kultivasi sel dalam media yang sesuai, pemecahan dinding sel, ekstraksi DNA genom, dan purifikasi DNA (Kurnia, 2011). Tahap-tahap amplifikasi DNA dengan PCR dimulai dengan tahap denaturasi, annealing, ekstensi/elongasi dan kembali ke tahap awal dengan jumlah siklus yang sudah ditentukan (Sambrook dan Russell, 2001). Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dulu gel direndam di dalam larutan etidium bromid (Wibowo, 2009). Deteksi DNA dalam gel agarosa dilakukan dengan citra UV. Sinar UV yang digunakan dengan panjang gelombang 300 nm. Metode staining dan visualisasi DNA menggunakan ethidium bromide atau SYBR gold (Sambrook dan Russell, 2001). Gambar 1 menunjukkan bahwa sampel A positif mengandung KHV sedangkan sampel C negatif mengandung KHV. DNA KHV yang teramplifikasi saat PCR menunjukkan fragmen dengan panjang 300 kb. Hal tersebut didasarkan pada band sampel A sejajar dengan marker yang memiliki panjang 300 kb. Sedangkan tebal band menunjukkan seberapa banyak DNA/RNA virus yang teramplifikasi saat PCR. Keberhasilan pengujian sampel dengan metode PCR dipengaruhi oleh beberapa hal, antra lain faktor kontaminasi silang, umur reagen atau enzim yang dipakai, jumlah enzim yang dipakai, ketelitian saat poses ekstraksi, serta kondisi Page | 117 larutan buffer dan larutan etidium bromida yang dipakai. Jika melihat hasil yang didapat, pengerjaan praktikum ini sudah tergolong baik karena tidak adanya kontaminan sehingga hasil yang didapat dapat maksimal (Haliman dan Adijaya, 2005). Page | 118 IV. KESIMPULAN DAN SARAN 4.1 Kesimpulan Hasil visualisasi elektroforesis menunjukkan bahwa ikan uji A positif (+) mengandung Koi Herpes Virus dan ikan uji C negatif (-) mengandung Koi Herpes Virus. 4.2 Saran Dalam praktikum ekstraksi dan amplifikasi DNA selain menggunakan cara manual sebaiknya juga menggunakan KIT sehingga hasil PCR dapat dibandingkan antara kedua macam bahan tersebut. Selain itu dengan KIT waktu yang diperlukan akan lebih sedikit. Page | 119 DAFTAR PUSTAKA Gomez D.K., Joh S.J., Jang H., Shin S.P., Choresca Jr. C.H., Han J.E., Kim J.H., Jun J.W., Park S.C. 2011. Detection of koi herpesvirus (KHV) from koi (Cyprinus carpio koi) broodstock in South Korea. Aquaculture.311: 42-47. Haenen O.L.M, Way K, Bergmann S.M, Ariel E. 2004. The emergence of koi herpesvirus and its significance to European aquaculture. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 24:293–307. Haliman, R.W. dan D. Adijaya. 2005. Udang Vanamei, Pembudidayaan dan Prospek Pasar Udang Putih yang Tahan Penyakit. Penebar Swadaya.Jakarta. 75 pp. Handoyo, D dan A. Rudiretna. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas Vol 9(1): 17-19. Hendrick RP, Gilad O, Yun S, Spangenberg JV. 2000. A Herpes Virus Associated with Mass Mortality of Juvenile and Adult Koi, a Strain of Common Carp J. Aquatic Animal Health 12: 44-57. Kurnia, A. 2011. Dasar Teknologi DNA Rekombinan. Departemen Farmasi, Universitas Indonesia, Depok, Indonesia. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wira Usaha Muda. Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana Vol XXVI (1): 25-31. Sambrook J. and Russell D.W. 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Edisi ke-3. Vol.2. New York: (US). Cold Spring Harbor Laboratory Press. Sulistyaningsih, E. 2007. Polymerase Chain Reaction (PCR): Era Baru Diagnosis dan Manajemen Penyakit Infeksi. Biomedis Vol 1(1): 17-25. Wibowo, M. S. 2009. Elektroforesis. Sekolah Farmasi. Institut Teknologi Bandung. Page | 120

Judul: Deteksi Virus Dengan Teknik Pcr

Oleh: Fannoka Rijoly


Ikuti kami